Biotecnología: avanzan en estudios de análisis de ADN en árboles para asistir a las actividades forestales y frutales

Un artículo de investigación realizado por Susana N. Marcucci Poltri, María C. Martinez, Natalia C. Aguirre, Pamela V. Villalba, Cintia V. Acuña, Martín N. García, Juan G. Rivas, Horacio E. Hopp, del 1nstituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular – IABiMo/ INTA-CONICET (Instituto de Biotecnología-IB, INTA), expone los avances logrados con estudios con fines de mejoramiento, manejo y conservación de la diversidad, y de los recursos genéticos.

 

ARGENTINA (Mayo 2020).- Hoy en día, es conocido por toda la comunidad que el ADN (ácido desoxirribonucleico), material fundamental de la vida, es el que porta la información genética para constituir a cada ser vivo. Además, se sabe que se utilizan análisis de ADN en humanos para la determinación de paternidad y la confirmación de identidad en casos forenses, así como también para estudios epidemiológicos y para la detección de anomalías genéticas que causan enfermedades (como fibrosis quística o predisposición a enfermedades oncológicas, entre otras).

 

Este mismo tipo de análisis también se aplica en animales y vegetales con fines de mejoramiento, manejo y conservación de la diversidad, y de los recursos genéticos. Estos estudios son de suma importancia porque los mejoradores, productores e investigadores dedicados al mejoramiento genético y a la conservación -en particular de especies arbóreas-, muchas veces deben resolver situaciones que son prácticamente imposibles o demasiado lentas de realizar con las herramientas convencionales disponibles.

 

En las plantas, el ADN generalmente se extrae a partir de una pequeña muestra de hojas, que es triturada finamente en presencia de una solución acuosa con detergentes y sales, permitiendo que el ADN salga de las células y quede soluble en ese medio (Fig.1).

Figura 1: Pasos de la extracción de ADN a partir de hojas. A: Selección de hojas preferentemente jóvenes y de buen estado sanitario. B: equipo para la molienda automática del material previamente deshidratado. C: material molido y separado en tubos. D: separación del ADN luego del tratamiento con soluciones de sales y detergentes.

 

Una vez extraído, y luego de algunos tratamientos en el laboratorio, se generan los denominados marcadores moleculares, que representan distintos fragmentos de la molécula de ADN y cuyos perfiles permiten generar “códigos de barra” o “huellas digitales” característicos de cada individuo e invariables a lo largo de su vida.

Un ejemplo de su aplicación es la identificación de clones de árboles; resultando análogo a las evaluaciones de ADN en humanos para determinación de paternidad o para la confirmación de identidad en casos forenses. En este tipo de estudios, una muestra problema, que podría ser un árbol de algún clon o cultivar no identificado, se compara con materiales de referencia (que, en el caso de estudios en humanos, serían los posibles padres en el análisis de paternidad o muestras de sospechosos en un caso forense) usando los marcadores moleculares apropiados para su identificación.

 

Estos perfiles del ADN propios de cada individuo, también pueden ser agregados como información adicional durante la inscripción en el INASE (Instituto Nacional de Semillas) o en el RNC (Registro Nacional de Cultivares), para complementar los descriptores morfológicos tradicionales (características morfológicas, fisiológicas y fenológicas), permitiendo la caracterización y, al mismo tiempo, la distinción de los diferentes clones o cultivares ya registrados. Estas características deben ser estables a lo largo del tiempo y, en el caso de los árboles, se suelen manifestar tarde en el desarrollo del cultivo (dependiendo de cada especie).

 

Es por eso, que la identificación clonal basada en marcadores moleculares es beneficiosa ya que puede realizarse en cualquier momento durante el crecimiento activo del árbol, inclusive cuando es una pequeña plántula y no depende de la producción de flores y frutos, como ocurre con la mayoría de los descriptores morfológicos. Si bien las diferencias de los perfiles moleculares entre cultivares no son suficientes para inscribir una nueva variedad u otorgar un título de propiedad, sí pueden ser utilizados para la identificación unívoca de cultivares, con el fin de corroborar identidades genotípicas en el marco de las actividades de certificación y control de comercio que realiza el INASE. De este modo, los productores, mejoradores, técnicos asesores, viveristas, etcétera, disponen de una herramienta para controlar la trazabilidad (identificación de cada árbol) durante el proceso de mejoramiento, multiplicación, y comercialización de los plantines.

 

A lo largo de los años, los marcadores moleculares han evolucionado tanto en calidad como en cantidad, y actualmente se dispone de decenas de miles de marcadores en algunos grupos de organismos, favoreciendo análisis más amplios y completos de los genomas (conjunto de genes de un organismo, codificados en su ADN). Esto es posible gracias a que han mejorado las tecnologías de secuenciación (que decodifican el ADN) convirtiéndose en técnicas masivas de última generación, obteniendo millares de secuencias de ADN en poco tiempo y a un costo razonable.

 

En paralelo, han mejorado sustantivamente el desarrollo de las plataformas y algoritmos para análisis bioinformáticos complejos, las capacidades computacionales de software y hardware al igual que creció la disponibilidad de herramientas estadísticas capaces de procesarlos, permitiendo evaluar gran cantidad de datos.

 

Actualmente, existen múltiples bases de datos públicas de secuencias de ADN que permiten analizar las secuencias de numerosas especies, organismos e individuos y diseñar marcadores moleculares, para luego utilizarlos en las propias poblaciones que se desean evaluar (como por ejemplo para eucaliptos, álamos, pinos entre otras). Sin embargo, muchas veces los organismos de interés (como, por ejemplo, especies forestales nativas) no cuentan con esta información y entonces se recurre a estrategias de secuenciación de ADN específicas para poder diseñar y aplicar marcadores moleculares útiles para dicha especie.

 

Otro ejemplo de aplicación de análisis de los perfiles de ADN es el monitoreo de la diversidad y calidad genética en los Huertos Semilleros (HS) con el fin de prevenir que en generaciones avanzadas se afecten las ganancias genéticas esperadas. Asimismo, si se detectara un nivel de diversidad genética inferior a la diversidad media poblacional, se podría considerar la necesidad de realizar nuevas introducciones de material genético. Del mismo modo, los niveles de diversidad genética dentro del HS, representan indicadores claves que definirán la calidad de la semilla forestal y su potencial adaptación a futuros cambios de requerimientos de mercado y/o ambientales. También es posible, determinar los niveles de contaminación genética por polen foráneo de los HS, que podrían malograr el mejoramiento realizado y la calidad de la semilla producida.

 

Los estudios de ADN también se aplican al mejoramiento forestal propiamente dicho. En este aspecto, se pueden calcular las relaciones de parentesco reales entre los individuos y esta información permite además, mejorar los cálculos de la predicción de los valores de cría de los árboles. Es decir, con los estudios de ADN es posible predecir de manera más precisa las propiedades de interés forestal.

 

 

 

En el Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular – IABiMo – INTA-CONICET (Instituto de Biotecnología-IB, INTA), el grupo de trabajo de “Genómica Forestal y Frutal” desarrolla y aplica herramientas genómicas para asistir a los programas de mejoramiento genético de especies de eucaliptos, de cultivares de pecán y de ciruelo, aportando información para la caracterización y control de la calidad genética del material de propagación; para complementar la descripción de clones o cultivares durante la inscripción en el INASE o en el RNC; para el manejo asistido de la diversidad de las poblaciones de mejora y producción y, para la selección genética de los mejores individuos.

 

El grupo, tiene especial interés en el desarrollo y puesta a punto de metodologías de última generación para realizar estudios masivos en el ADN. Como ejemplo, recientemente ha desarrollado la metodología de “Genotipado por secuenciación” para generar miles de marcadores moleculares en Eucalyptus dunnii (Fig.2), una especie muy interesante desde el punto de vista forestal por su desempeño y tolerancia al frío, para la cual anteriormente no existían recursos genómicos específicos o estaban muy limitados. El protocolo desarrollado permitió que esta metodología fuera aplicada con éxito en nuestro país en diversas especies debido a su gran versatilidad (por ejemplo ciruelo, duraznero, girasol, cactus, entre otras) sin necesidad de recurrir a servicios en el exterior.

Figura 2: Distribución de los marcadores moleculares generados a lo largo de los 11 cromosomas (eje y) de eucalipto, manifestando su amplia distribución y cobertura genómica en todos ellos (eje x).

 

 

El grupo también, ha desarrollado estudios para implementar nuevas estrategias de mejoramiento basadas en Mapeo por Asociación y Selección Genómica en diferentes especies del género Eucalyptus.

El Mapeo por asociación emplea poblaciones diversas y permite localizar aquellas regiones del genoma que son en parte responsables de la manifestación de las características evaluadas de interés para la producción forestal. Al encontrar regiones genómicas asociadas a características de interés, disponiendo de secuencias completas o bastante avanzadas de los genomas del cultivo de referencia, y considerando las investigaciones adelantadas en especies modelo, es posible detectar aquellos genes potencialmente responsables de la característica estudiada (Figura .3).

Figura 3: Marcadores moleculares asociados a distintas características de interés forestal. Los marcadores (puntos de colores) se ubican en los 11 cromosomas (eje x), y los que sobrepasan el umbral de significancia (eje y, línea horizontal verde) son los que se asocian a las características evaluadas.

 

Con dicha información se puede avanzar aún más, aplicando otra herramienta del mejoramiento actual como lo es la “edición génica” en el ámbito forestal. La edición génica permite reemplazar o corregir secuencias de ADN de los genes. Sin embargo, la mayor dificultad de esta metodología reside en la selección del gen a editar, el cual debe presentar un efecto importante sobre la característica en cuestión y que se quiere modificar. Por lo tanto, para que estos genes estén bien caracterizados es necesario realizar estudios rigurosos en poblaciones de gran tamaño, y hacer verificaciones mediante análisis que permitan garantizar el comportamiento deseado.

 

Por el otro lado, la Selección Genómica tiene el objetivo de predecir el comportamiento forestal explorando sólo los perfiles de ADN sobre una población de mejoramiento de interés. Esto se realiza mediante la generación de un modelo predictivo a partir del entrenamiento de algoritmos, empleando poblaciones que cuentan con datos individuales de caracteres de interés forestal medidos y sus respectivos perfiles moleculares. El modelo obtenido permite predecir las características de producción en una nueva generación de árboles, a edades tempranas, evaluando solamente sus perfiles de ADN.

 

Todo el trabajo del grupo se realiza en estrecha colaboración principalmente con investigadores, genetistas y mejoradores de estaciones experimentales agropecuarias de INTA (EEA Concordia, CR-Entre Ríos; EEA Bella Vista, CR-Corrientes; Delta del Paraná, CR -Buenos Aires) e institutos de investigación del INTA (Instituto de Recursos Biológicos, IRB-CIRN e Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola, IMyZA-CICVyA) y más recientemente con la Facultad de Ciencias Forestales, UNSE (Universidad Nacional de Santiago del Estero).

 

 

El objetivo final del grupo es la asistencia a los programas de mejoramiento genético forestal y frutal de las especies mencionadas, la divulgación y la transferencia de las herramientas moleculares y estudios que se realizan a otros programas. Es por ello que varias de estas metodologías han sido transferidas a la Unidad de Genómica del IB para la identificación y trazabilidad de materiales clonales de eucaliptos y pecán, posibilitando que se ofrezcan servicios a terceros fundamentalmente viveros y mejoradores.

 

(*) Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular – IABiMo – INTA-CONICET (Instituto de Biotecnología-IB, INTA)

 

 

 

Este artículo forma parte del espacio mensual de la REDFOR.ar, en ArgentinaForestal.com,  que busca divulgar y generar debate sobre la problemática forestal del país. Las opiniones pertenecen a los autores.